生物大数据分析
6 . 转录组测序和分析
桂松涛 Blog
songtaogui@163.com
2024年11月
RNA和转录组
|
RNA的分类 维基百科
|
 |
|||
|
|
转录组研究
|
|
|
|
|
RNA-SEQ的挑战
RNA-SEQ分析内容和技术路线
|
|
|
|
|
测序前的步骤
|
 
|
|
|
测序公司代劳
Q=−10∗log10(P) P: Base calling error probability |
   |
|
|
测序公司代劳
|
 
|
|
|
测序数据质量控制: FastQC
|
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
FastQC: 质量值统计
|
|
|
|
FastQC: 质量值统计 per sequence
|
|
|
|
FastQC: 序列组成统计 per sequence
|
|
|
|
FastQC: GC含量分布 per sequence
|
|
|
|
FastQC: N碱基分布 per sequence
|
|
|
|
FastQC: 重复序列比例
|
|
|
|
FastQC: 完全一样的reads频率
输出在总reads中出现次数超过0.1%的reads;
大量高比例的reads可能表示测序污染;
FastQC: 接头序列含量
|
|
|
|
数据清洗: Trimming
|
|
|
|
序列比对: WGS Mapping
|
|
|||
|
|
序列比对: RNA-Seq Mapping
|
常用的RNA-Seq比对软件:
|
RNA-Seq序列比对与DNA比对的区别 
|
|
|
Alignment Free quantification
|
|
|
|
无参转录本分析: 转录本组装
|
Genome-Guide assembly 
|
De novo assembly 
|
|
Martin, J., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet 12, 671–682 (2011).
|
转录本定量: 计数
|
|
转录本定量: 计数
转录本定量: 标准化
|
RNA-Seq Reads Count的标准化
 |
CPM=GA∗1E6 RPKM/FPKM=G∗LA/1000A∗1E6 TPM=∑(RPKA)RPKA∗1E6whereRPKA=LA/1000A |
转录本定量: 过滤低表达基因
转录本定量: 其他标准化方法
|
di=SiSbaseline
xip=dixi
Quantile normalization: WIKIPEDIA
|
|
|
转录本定量: 其他标准化方法
大多数基因的表达是不存在差异的，将稳定的部分找出来，作为标准化的内参，依据内参算出各个样本的标准化因子:
|
基本思想与DESeq2相似, 区别在于内参的选择: TMM选择一组内参基因集合, 进行加权平均
|
|
|
样本质控: 数据整体分布的相似性
|
如何快速评估高维数据的特征? –> 降维分析 –> 主成份分析(PCA)
 |
|
|
样本质控: 主成份分析
主成份分析(Principal components analysis, PCA)是很经典的降维算法，可用来降噪、消除冗余信息等。
|
极端例子:Y轴数据提供信息量少，可以直接舍弃
 |
一般情况: X&Y信息变化大，需要通过降维算法进行计算
 |
|
|
样本质控: 主成份分析
 |
|
|
|
样本质控: PCA分析案例
样本质控: PCA分析案例
样本质控: PCA分析案例
差异分析: 重复
生物学重复 vs 技术重复
差异分析: 重复
重复越多，对总体均值和方差的估计越准确，越能得到更多DEG。
|
|
|
|
差异分析: 统计分布
传统数据的差异分析(多组: ANOVA):
|
|
泊松分布? 负二项分布! Reads count是离散的非零整数, 对应的分布也是离散分布。
|
|||
|
|
差异分析: 方差估计
|
|
|
|
差异分析: 多重假设检验校正
H0: You are not pregnant; H1: You are pregnant
 |
 |
|
|
差异分析: 多重假设检验校正
|
差异基因分析: |
 |
|
|
差异分析: 多重假设检验校正
如果多次假设检验的结果之间有影响，或需要将多次假设检验的结果合并分析，则需要校正。
例：寻找两种条件下具有差异表达的基因，我们会对每个基因在两组样本里的表达量分别进行检验（多重假设检验），但最后获得所有差异表达基因时需要将上述各结果合并，若不进行校正，则差异表达基因中假阳性结果就较多，故需要校正。
反之，如果多次假设检验的结果仅用来单独分析，不会将结果合并，则无需校正。
例：将基因分成几个基因集，比较这几个基因集之间某特征是否有显著差异，因两两之间的比较与其他基因集并无关联，故不需要校正。
差异分析: 多重假设检验校正常用方法
|
Family Wise Error Rate: 控制假阳性率为0
|
FDR矫正: 允许一定的假阳性率
|
|
|
差异分析: 结果解读
Fold Change; P-value; P_adj/FDR/Q-value
差异分析结果展示
|
火山图  |
聚类热图  |
|
|
差异基因下游分析: 富集分析
卡方检验
Fisher精确性检验
KS检验
差异基因下游分析: 富集分析
在 背景基因集(N) 下获得 一组特定基因集(S)，
S可能是基因列表，表达图谱，基因芯片等形式。
用预先构建好基因注释数据库(例如GO,KEGG等)已对背景基因集(N)根据生物功能或过程进行分类
通过统计学算法找出有那些显著区别于背景基因集(N)的类别(生物组成/功能/过程)
或者找出这组特定基因集间在生物组成/功能/过程的共性
经过聚类后去除冗余得到基因富集结果的过程，即为富集分析。
差异基因下游分析: 富集分析
差异基因下游分析: 富集分析 -> 基因本体论(Gene ontology, GO)
|
分子功能（Molecular Function，MF ）
细胞组分（Cellular Component ，CC）
生物过程（Biological Process ，BP）
|
|
|
|
GO 富集结果示例
|
|
|
|
RNA-Seq分析实操流程
nf-core/rnaseq: https://github.com/nf-core/rnaseq
