测序技术发展简史

测序技术原理: 第一代测序技术

Sanger测序法 1977年, 英国的 Frederick Sanger发明; 双脱氧链终止; 电泳分离; 放射自显影; 荧光素标记; 毛细管电泳;

测序技术原理: 第一代测序技术

测序技术原理: 第一代测序技术

测序技术原理: 第一代测序技术

为什么头尾信号乱? 测序反应1000 bp左右, 有效碱基750bp左右

测单端? 测双端? 测通?

测序技术原理: 第一代测序技术

测序技术原理: 第一代测序技术

测序技术原理: 第一代测序技术

测序技术原理: 第二代测序技术

序列打断; 末端修复、片段分选; 连接接头; PCR扩增; 信号检测;

测序技术原理: 第二代测序技术

测序技术原理: 第二代测序技术

MGI-DNB测序 Complete Genomics研发; 2013年华大(BGI)收购; DNA纳米球测序(DNB-Seq); DNB制备; 规则阵列芯片; DNB加载; 联合探针聚合测序; 二链测序; 碱基识别; DNBSEQ-T7: 24h产生7Tb的PE-150读段(目前测序通量最大的平台之一)

测序技术原理: 第二代测序技术

测序技术原理: 第二代测序技术

测序技术原理: 第二代测序技术

测序技术原理: 第三代测序技术-SMRT

测序技术原理: 第三代测序技术

测序技术原理: 第三代测序技术-ONT

测序技术原理: 一二三代测序的优缺点

• 一代:

  • 反应体系小, 适合小样本测序, 准确度最高, 测序读长长;

  • 通量低, 价格贵, 应用范围窄

• 二代:

  • 通量高, 准确度较高, 应用范围广, 衍生了多种组学技术, 便宜;

  • 读长短, 测序错误有偏好性

• 三代:

  • 读长超长, 单分子实时测序, 测序错误随机

  • 错误率高(以前), 通量低(以前), 贵

RNA和转录组

RNA的分类 维基百科 mRNA tRNA rRNA snRNA snoRNA miRNA siRNA lncRNA circosRNA ...... 转录组 某个物种或特定细胞在某一生理功能状态下，细胞内所有转录的RNA产物的集合 时间限定和空间限定 DNA => RNA => Protein 转录调控是目前研究最多的调控方式

转录组研究

RNA-SEQ的挑战

RNA-SEQ分析内容和技术路线

测序前的步骤

总RNA提取 RNA富集 RNA片段化 随机引物cDNA合成 测序接头

测序公司代劳

Sequencing Base calling Q Score \( Q = -10 * log_{10}(P)\) P: Base calling error probability

测序公司代劳

Sequencing Base calling De-multiplexing

测序数据质量控制: FastQC

统计指标 描述 Number of Reads reads数目 Data Size 碱基数量 N of fq1 reads1中N碱基数目 N of fq2 reads2中N碱基数目 Low qual base of fq1(<=15) reads1中低质量的碱基数目 Low qual base of fq2(<=15) reads2中低质量的碱基数目 Q20 of fq1 reads1中质量值>=20的碱基所占的比例 Q20 of fq2 reads2中质量值>=20的碱基所占的比例 Q30 of fq1 reads1中质量值>=30的碱基所占的比例 Q30 of fq2 reads2中质量值>=30的碱基所占的比例 GC of fq1 reads1的GC含量 GC of fq2 reads2的GC含量 Error of fq1 reads1的错误率 Error of fq2 reads2的错误率 Discard Reads related to N and low qual N碱基和低质量的reads所占比例 Discard Reads related to Adapter 带接头的reads比例

FastQC: 质量值统计

	Boxplot X: Base pair Y: Q score GOOD: 下四分卫数 > 30 WARN: 下四分卫数 < 10 or Median < 25 FAIL: 下四分卫数 < 5 or Median < 20

FastQC: 质量值统计 per sequence

	Density Plot X: Mean Q score per reads Y: Number of reads GOOD: 90% reads has Q > 35 WARN: Peak < 27 (error rate > 0.2%) FAIL: Peak < 20 (error rate > 1%)

FastQC: 序列组成统计 per sequence

	Line Plot X: Base pair Y: Percentage 随机文库中，理论上四种碱基出现概率相当 平行但分开的线: 文库bias或测序系统误差 WARN: 任一位置的A/T vs G/C相差 > 10% FAIL: 任一位置的A/T vs G/C相差 > 20%

FastQC: GC含量分布 per sequence

	Line Plot X: Mean GC Content (%) Y: Reads count cnote{蓝线}: 理论分布(正态分布) cerror{红线}: 实际分布 形状偏离正态分布: 文库污染、reads代表性有偏... 形状接近正态，但偏离理论分布: 系统误差 WARN: 偏离理论分布的reads > 15% FAIL: 偏离理论分布的reads > 30%

FastQC: N碱基分布 per sequence

	Line Plot X: BP Y: Percentage of N 正常情况下N的比例很小: 紧贴X轴的水平线 "鼓包": 测序系统问题 WARN: 当任意位置的N的比例超过5% FAIL: 当任意位置的N的比例超过20%

FastQC: 重复序列比例

	Line Plot X: Sequence Duplication Level Y: Reads percentage 建库过程会产生重复, 测序本身也会产生重复; WARN: 当非unique的reads占总数的比例大于20%时，报"WARN"； FAIL: 当非unique的reads占总数的比例大于50%时，报"FAIL“。

FastQC: 完全一样的reads频率

• 输出在总reads中出现次数超过0.1%的reads;

• 大量高比例的reads可能表示测序污染;

FastQC: 接头序列含量

	Adapter序列在reads中出现的概率 WGS测序中不太会测到接头(片段长) RNA-Seq中有短序列，有可能测到接头 "鼓包": 测序系统问题 WARN: > 5% FAIL: > 10%

数据清洗: Trimming

去除Adapter序列 去除序列两端低质量碱基 删除低质量的reads 删除长度过短的reads trimmomatic cutadapt fastp

序列比对: WGS Mapping

序列联配 计分矩阵 Gap罚分 动态规划 序列索引(FM-index) ...	WGS mapping SAM/BAM Format

序列比对: RNA-Seq Mapping

常用的RNA-Seq比对软件: Bowtie/ Tophat BWA STAR HISAT2 minimap2	RNA-Seq序列比对与DNA比对的区别

Alignment Free quantification

Kmer based Ultra Fast kallisto Salmon Trade-off 对mRNA等长序列，与比对方法结果相当 对短序列(miRNA等), 效果较差 Wu, D., Yao, J., Ho, K. et al. Limitations of alignment-free tools in total RNA-seq quantification. BMC Genomics 19, 510 (2018).

无参转录本分析: 转录本组装

Genome-Guide assembly	De novo assembly
Martin, J., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet 12, 671–682 (2011).

转录本定量: 计数

转录本定量: 计数

转录本定量: 标准化

RNA-Seq Reads Count的标准化

A: 比对到基因A的reads数 G: 比对到全基因组的reads数 \(L_A\): 基因A的长度 \( CPM = \frac{A * 1E6}{G} \) \( RPKM/FPKM = \frac{A * 1E6}{G * L_A / 1000} \) \( TPM = \frac{RPK_A * 1E6}{\sum{(RPK_A)}} \quad where \quad RPK_A = \frac{A}{L_A / 1000}\)

转录本定量: 过滤低表达基因

转录本定量: 其他标准化方法

管家基因 Spike-in: 建库时添加绝对定量内参 External RNA Controls Consortium	TCS (Total Count Scaling) \( d_i = \frac{S_{baseline}}{S_i} \) \( x^p_i = d_i x_i \) Quantile: 排序后求平均再回序 Quantile normalization: WIKIPEDIA

转录本定量: 其他标准化方法

样本质控: 数据整体分布的相似性

	如何快速评估高维数据的特征? –> 降维分析 –> 主成份分析(PCA)

样本质控: 主成份分析

主成份分析(Principal components analysis, PCA)是很经典的降维算法，可用来降噪、消除冗余信息等。

极端例子:Y轴数据提供信息量少，可以直接舍弃	一般情况: X&Y信息变化大，需要通过降维算法进行计算

样本质控: 主成份分析

	在新坐标系下，Y轴数据可以进行舍弃; 数据的具体数值不重要，重要的是分布(数据之间的关系); 降维的原理: 更改坐标轴(正交变换), 取新坐标轴上前K个变化最大的轴上的数据，实现N->K的降维; 深入理解的数学概念: 正交变换、正交矩阵、协方差、特征值分解、奇异值分解...

样本质控: PCA分析案例

样本质控: PCA分析案例

样本质控: PCA分析案例

差异分析: 重复

生物学重复 vs 技术重复

差异分析: 重复

重复越多，对总体均值和方差的估计越准确，越能得到更多DEG。

差异分析: 统计分布

传统数据的差异分析(多组: ANOVA):

RNA-Seq为何不适用传统的统计分析? 不符合正态分布: 生物学重复少(n < 10) 基因表达不能为负数 Reads count是非连续的 基因表达量数据离散程度高度扭曲: 方差>>均值 两个核心问题 基因表达数据适合用什么分布进行差异显著性检验？ 如何利用少量生物学重复数据估算基因表达的标准差？	泊松分布? 负二项分布! Reads count是离散的非零整数, 对应的分布也是离散分布。 泊松分布: 均值和方差相等 负二项分布: 契合数据特征

差异分析: 方差估计

差异分析: 多重假设检验校正

差异分析: 多重假设检验校正

差异基因分析: 判断单个基因为差异基因的Cutoff: P < 0.05 100个基因中，约有5个基因可能是假阳性结果 10000个基因 –> 500个假阳性结果 –> 整体错误增多 需要对P值进行矫正，从而控制整体错误率

差异分析: 多重假设检验校正

• 如果多次假设检验的结果之间有影响，或需要将多次假设检验的结果合并分析，则需要校正。

  • 例：寻找两种条件下具有差异表达的基因，我们会对每个基因在两组样本里的表达量分别进行检验（多重假设检验），但最后获得所有差异表达基因时需要将上述各结果合并，若不进行校正，则差异表达基因中假阳性结果就较多，故需要校正。

• 反之，如果多次假设检验的结果仅用来单独分析，不会将结果合并，则无需校正。

  • 例：将基因分成几个基因集，比较这几个基因集之间某特征是否有显著差异，因两两之间的比较与其他基因集并无关联，故不需要校正。

差异分析: 多重假设检验校正常用方法

差异分析: 结果解读

Fold Change; P-value; P_adj/FDR/Q-value

差异分析结果展示

火山图	聚类热图

差异基因下游分析: 富集分析

差异基因下游分析: 富集分析

S可能是基因列表，表达图谱，基因芯片等形式。

用预先构建好基因注释数据库(例如GO,KEGG等)已对背景基因集(N)根据生物功能或过程进行分类

通过统计学算法找出有那些显著区别于背景基因集(N)的类别(生物组成/功能/过程)

或者找出这组特定基因集间在生物组成/功能/过程的共性

经过聚类后去除冗余得到基因富集结果的过程，即为富集分析。

差异基因下游分析: 富集分析

差异基因下游分析: 富集分析 -> 基因本体论(Gene ontology, GO)

分子功能（Molecular Function，MF ） 单个的基因产物（包括蛋白质和RNA）或多个基因产物的复合物在分子水平上的活动，比如“催化”，“转运” 需要注意，这里的描述只表示活动，而不指定执行功能的实体（分子或复合物），动作发生的地点，时间或背景 细胞组分（Cellular Component ，CC） 基因产物在执行功能时所处的细胞结构位置，比如在线粒体，核糖体 需要注意：细胞组分是细胞解刨结构，不指代过程 生物过程（Biological Process ，BP） 通过多种分子活动完成的生物学过程 需要注意：生物学过程不等同于通路。目前，GO没有表示完整的通路信息所需的动力学或依赖性的描述信息

GO 富集结果示例

RNA-Seq分析实操流程

nf-core/rnaseq: https://github.com/nf-core/rnaseq